Jasiu Baumann - strona domowa

Profesor David Segal stoi na czele laboratorium badawczego „The Genome Center” na uniwersytecie kalifornijskim w Davis. Głównym celem tego laboratorium jest zaprojektowanie białka, które może wiązać się z DNA i „włączać” lub „wyłączać” ekspresję określonych genów. Takie białka wiążące DNA, mają potencjał do stosowania ich w „ukierunkowanej” terapii genowej dla chorób o znanym podłożu genetycznym. Na przykład takie podejście może pozwolić osobom z Zespołem Angelmana nadrobić utratę lub brak aktywności genu UBE3A na chromosomie dziedziczonym od matki, przez „włączanie” lub ekspresję genu UBE3A odziedziczoną po ojcu.

Profesor Segal jest współautorem artykułu przeglądowego w „BMC Neuroscience” zatytułowanego „Perspektywa terapii molekularnej dla zespołu Angelmana i innych jednogenowych zaburzeń neurologicznych” (ang. The prospect of molecular therapy for Angelman syndrome and other monogenic neurologic disorders). W artykule omówiono zastosowanie białek wiążących DNA zwane sztucznym zapisem czynników jako potencjalnej metody leczenia Zespołu Angelmana. Zapytaliśmy profesora Segala o technologię opisaną w artykule oraz skutki jakie mogą się pojawić w przypadku osób z Zespołem Angelmana.

Poniżej przedstawiam wywiad z profesorem Davidem Segalem (opublikowany w dniu 1.10.2014r na portalu http://cureangelman.net/ przez Annie Murphy).

– Jaki jest kierunek terapii ekspresji genowej?

W niektórych typach chorób genetycznych, są geny, które będziemy mogli włączyć lub wyłączyć w celu leczenia choroby. Niestety, leki nie robią tego dobrze. Leki są dobre w przypadku hamowaniu enzymów, które odpowiedzialne są za występowanie reakcji chemicznych w komórce lub w przypadku wiązania z receptorami na powierzchni komórki, do blokowania ścieżki sygnalizacji. Zwykle nie można włączyć określonych genów. Istnieją także pewne leki, które działają na ogólnych mechanizmach regulujących ekspresję genów. To jest „nieukierunkowana” terapia ekspresji genów, ponieważ leki te wpływają na ekspresję wielu genów. Moje laboratorium uważa, że jeśli chcemy włączyć określone geny lub je wyłączyć, należy starać się zrozumieć, w jaki sposób robi to natura. Natura wykorzystuje białka zwane czynnikami transkrypcji (zapisu), które wiążą się z konkretnymi sekwencjami DNA. W ten sposób czynniki transkrypcyjne aktywują lub hamują tylko właściwy gen. Staramy się, aby przyjąć to samo podejście, aby utworzyć „ukierunkowaną” terapię ekspresji genów dla Zespółu Angelmana.

-Dlaczego „ukierunkowana” terapia ekspresji genów, byłaby odpowiednia w przypadku Zespołu Angelmana ?

Zespół Angelmana spowodowany jest utratą ekspresji genu UBE3A w mózgu na matczynym chromosomie, co oznacza, że białko UBE3A nie jest wytwarzane. Regulacja ekspresji UBE3A w mózgu jest niezwykle złożona i utrata ekspresji może być spowodowana kilkoma różnymi typami mutacji lub błędów występującymi w przypadku genu UBE3A położonego na matczynym chromosomie, który ten chromosom dziecko dziedziczy od matki.

Jednak we wszystkich przypadkach występuje doskonale dobra kopia genu UBE3A na ojcowskim chromosomie, który jest odziedziczony po ojcu. W mózgu ta kopia genu UBE3A jest normalnie „wyciszona” (nieaktywna) przez ekspresję jeszcze innego genu, zwanego zapisem UBE3A-ATS (ang. UBE3A-antisense transcript).

UBE3A i zapis UBE3A-ATS są położone na tej samej ścieżce, jak dwa pociągi zmierzające do siebie na tym samym torze. Zazwyczaj gen UBE3A jest przegrany w tym wyścigu (ang. contest), więc nie wytwarza on swojego białka, ponieważ jego droga jest zablokowana przez ekspresję zapisu UBE3A-ATS. Jeśli moglibyśmy sprawić, aby gen UBE3A był silniejszy, to bardzo prawdopodobne że byłby wtedy zwycięzcą (w tym wyścigu), albo gdybyśmy mogli obniżyć zapis UBE3A-ATS, tak że bardziej prawdopodobne byłoby, że byłby „przegrany”, to może będziemy w stanie przywrócić ekspresję genu UBE3A (ang. UBE3A expression) w mózgu. Warto wspomnieć, że w większości innych chorobach genetycznych występują obie kopie (ojcowska i matczyna) zmutowanego genu i w tym przypadku nie pomaga, włączyć lub wyłączyć te geny. W tym przypadku, niezwykła regulacja genu w regionie genu UBE3A daje nam szczególną możliwość „ukierunkowanej” terapii genowej.

Zastosowanie sztucznych czynników transkrypcyjnych do terapii „ukierunkowanej” na ekspresję genów jest omówione w Twoim artykule. Jakie są sztuczne czynniki transkrypcyjne?

Czynniki transkrypcyjne (ang. transcription factors) są jednym z głównych narzędzi jakie natura wykorzystuje w celu włączenia lub wyłączenia genu.

Są to białka, które zwykle składają się z dwóch części. Jedna część jest nazywana domeną efektorową (ang. an effector domain), która oddziałuje (ang. interacts) z innymi białkami w komórce powodując włączenie lub wyłączenie genu. Druga część to domena wiążąca DNA (ang. DNA-binding domain), która może wyszukać i wiązać się ze specyficzną sekwencją DNA, a tym samym doprowadzić do domeny efektorowej do konkretnego genu. Aby wywołać sztuczny czynnik transkrypcyjny, „kradniemy” domenę efektorową naturalnego czynnika transkrypcyjnego i dołączamy go do programowalnych domen wiążących DNA (ang. programmable DNA-binding domains).

Wiele badań naukowych poświęcono, aby wykonać wysokiej jakości programowalne domeny wiążące DNA i są one cały czas poprawiane. Nazywamy je: „zinc fingers, TALEs i CRISPRs”. Wynikiem tego jest sztuczny czynnik transkrypcyjny, dzięki któremu można włączyć lub wyłączyć jakikolwiek gen, który można zaprogramować, a w przypadku Zespołu Angelmana jest to albo UBE3A lub zapis UBE3A-ATS.

– Jak sądzisz, jakie korzyści w tym przypadku będziemy mieli w odróżnieniu od terapii cząsteczkami lub przy opracowaniu terapii genowej?

Takie podejście powinno regulować gen gdzie naturalnie występuje w chromosomie i mogą być pewne korzyści z tego faktu. Istnieje wiele sposobów regulacji genów, które nie w pełni rozumiemy. Na przykład, gen UBE3A faktycznie wytwarza co najmniej trzy nieco różne formy białka UBE3A zależności od zmian w procesie, który przekształca sekwencje genu do kodowanego białka.

Mimo, że sądzimy, że to wszystko dzieje się prawie tak samo, niektóre formy białka UBE3A kończą się w jądrze komórkowym, a inne w różnych częściach komórki.

Tradycyjna terapia genowa będzie polegać na wprowadzeniu nowej zdrowej kopii genu w wektorze wirusowym (sekwencja DNA zmodyfikowanego wirusa), który wyraża gen przy użyciu własnego mechanizmu. Za pomocą tego sposobu tylko jedna forma białka zostanie utworzona. Nasza metoda wykorzystuje komórki w normalnym mechanizmie i pozwala, aby wszystkie naturalne formy zostały utworzone.

Kolejna ważna lekcja jaką dowiedzieliśmy się o terapii genowej to sprawa dawkowania.

Zbyt mała ekspresja genów może być zła, ale zbyt duża, również może być zła. Na przykład zbyt duże wyrażenia genu UBE3A jest związane z autyzmem. Nasze podejście może zaoferować możliwość dostosowania dawki ekspresji genów dla jednostki, w podobny sposób jak terapie przy użyciu leków.

Istnieją inne rodzaje terapii „ukierunkowanej” na kopię chromosomu UBE3A lub zapisu UBE3A-ATS, takie jak terapia antysensowna oligonukleotydowa (ang. the antisense oligonucleotide therapy) zapoczątkowana przez doktora Arthura Beaudet¹ z Baylor College of Medicine. Metoda ta wykorzystuje krótkie, syntetyczne sekwencje kwasów nukleinowych, tzw. budowane bloki DNA (ang. building blocks), do blokowania ekspresji określonych genów poprzez zapobieganie tworzenia białek. To może mieć podobne zalety lub różne korzyści dla sztucznych czynników transkrypcyjnych. Ostatecznie kilka sposobów może być przydatnych lub jedna z metod może okazać się bardziej efektywna niż inne, to po prostu musimy wiedzieć. W każdym przypadku, testując kilka strategii gwarantujemy, że społeczność Angelmana jest zawsze zwycięzcą, ponieważ będzie wiedzieć, że cokolwiek okaże się najbardziej przydatne będzie najlepsze, co wszyscy możemy zrobić, a nie najlepsze, co jedna osoba może zrobić.

Uwaga ¹ redakcji: Antysensowne podejście oligo Dr.Beaudet ma na celu zablokować zapis UBE3A-ATS i umożliwić ekspresję ojcowskiej kopii genu UBE3A.

– Czy będzie możliwe dostarczenie sztucznych transkrypcyjni terapeutycznych czynników do określonych obszarów mózgu, które są dotknięte Zespołem Angelmana?

Nasza obecna wiedza jest taka, że ekspresja genu UBE3A jest utracona w mózgu w przypadku Zespołu Angelmana. Nasze wstępne dane wskazują, że nasze sztuczne czynniki transkrypcyjne mogą zostać rozpowszechnione w mózgu, o wiele bardziej niż jakikolwiek znany obecnie wektor wirusowy. Jednakże, takie rozpowszechnianie pozostaje aktywnym obszarem badań w tym projekcie, a my wciąż udoskonalamy i wprowadzamy usprawnienia, aby robić to najlepiej jak potrafimy.

– Czy uważasz, że ten rodzaj terapii może zaoferować leczenie wszystkich objawów Zespołu Angelmana?

Nie sądzę, że ktoś naprawdę wie, czy przywrócenie do pełnej funkcjonalności genu UBE3A naprawi wszystkie objawy Zespołu Angelmana. Około 70% chorych osób ma dużą delecję, która usuwa poza UBE3A inne geny. Mimo, że jest jeszcze jeden egzemplarz tych genów na ojcowskim chromosomie, który jest aktywny (w przeciwieństwie do ojcowskiej kopii genu UBE3A, która jest wyciszona), utrata nawet jednego egzemplarza tych genów z chromosomu matczynego może przyczynić się do niektórych neurologicznych objawów Zespołu Angelmana. Eksperymenty, aby lepiej zrozumieć ten mechanizm, są w toku i to jest kolejna rzecz, której wciąż musimy się uczyć.

– Czy są może jakieś skutki uboczne tego rodzaju terapii?

Ponieważ nasz sztuczny czynnik transkrypcji (ang. artificial transcription factor) zwykle nie występuje w naturze, to zawsze bierzemy pod uwagę możliwość wystąpienia odrzucenia w postaci odpowiedzi immunologicznej.  Prawdopodobnie taka terapia nie powoduje wystąpienia szkodliwych skutków ubocznych, ale może zmniejszyć jego skuteczność. Ponadto, jak w przypadku leków, mogą wystąpić inne skutki uboczne, jeśli czynnik reguluje inne geny w sposób niezamierzony. Kwestia skutków ubocznych to jest sprawa, którą naprawdę chcemy zrozumieć, zanim będziemy myśleć o jakichkolwiek badaniach na ludziach.

– Jak długo to może potrwać, zanim dowiemy się, czy mogą być one odpowiednie do leczenia ludzi?

Naukowcy i cała społeczność Angelmana ma to szczęście posiadać dwa źródła bardzo dobrze finansowane wsparcie w „Angelman Syndrome Foundation” oraz „Foundation for Angelman Syndrome Therapeutics”. Moja praca jest w większości finansowana przez nie i podchodzą one bardzo poważnie, aby szybko osiągnąć efekty, mogące pomóc ludziom. Ale, parafrazując Einsteina, nauka powinna poruszać się tak szybko, jak to możliwe, ale nie szybciej (ang. science should move as quick as possible, but not quicker). Musimy lepiej zrozumieć możliwość wystąpienia skutków ubocznych i odpowiedzi immunologicznej. Musimy zbadać różne schematy dawkowania i metody dostarczania. Niestety, te eksperymenty kosztują czas, aby były wykonane poprawnie. Więc nie mogę nic obiecać na temat, kiedy będziemy gotowi do badań klinicznych, mogę tylko obiecać, że będziemy wciąż próbować.

– Czy możesz powiedzieć nam coś jeszcze o badaniach nad Zespołem Angelmana, które wykonuje twoje laboratorium i w jak sposób to przebiega?

Rozwijamy sztuczne czynniki transkrypcyjne (ang. artificial transcription factors) dla terapii „ukierunkowanej” ekspresji genów UBE3A w mysim modelu Zespołu Angelmana. Czynniki oparte są na białkach wiążące DNA zwane ‚zinc finger proteins’, które rozpoznają i są ukierunkowane na poszczególne obszary DNA.

Czynnik został zaprojektowany, aby zmniejszyć zapis UBE3A-ATS (ang. Ube3a -antisense transcript down) w ojcowskim chromosomie, który mieliśmy nadzieję, że przywróci wyrażanie genu UBE3A w mózgu.

Nasze wstępne dane sugerują, że jesteśmy w stanie wstrzyknąć ten oczyszczony czynnik (ang. purified factor) myszom i jest rzeczywiście możliwe osiągnięcie aktywacji ekspresji genu UBE3A w mózgach myszy. Jest to z kilku powodów wynik bardzo ekscytujący dla nas.

Większość wstrzykiwanych białek, jak również wiele leków nie są w stanie przekroczyć barierę krew-mózg (ang. cross the blood-brain barrier), membranę ściśle upakowanych komórek, które chronią mózg od obcych substancji we krwi.

Jednak wydaje się, że nasze zaprojektowane białka są w stanie przekroczyć tę barierę. Wydaje się również, że zaktywowaliśmy gen UBE3A, za pomocą specjalnego przeciwciała, które wiąże się z obszarem i jesteśmy mocno przekonani, że to jest wyciszony ojcowski egzemplarz, który jest teraz włączony. Mówię „wydaje” i „sugeruje” dlatego, że nie opublikowaliśmy jeszcze tych ustaleń, co oznacza, że nasza praca nie została poddana przeglądowi przez innych naukowców. Chcemy, a wspólnota Zespołu Angelmana również powinna pragnąć, aby każdy mógł spojrzeć na naszą pracę i powiedzieć, że zgadza się, że to prawda. Jako naukowiec muszę być największym sceptykiem mojej własnej pracy, a część która starannie buduje dowody, jest to, że co myślimy, naprawdę się dzieje. Mamy nadzieję, że wkrótce opublikujemy pierwszy rozdział naszej historii.

Jednak nie będzie więcej rozdziałów, ponieważ jest jeszcze wiele rzeczy, które musimy się nauczyć, zanim będziemy mogli myśleć o próbie aktywacji genu UBE3A na ludziach. Musimy zrozumieć potencjalne skutki uboczne naszego leczenia i czy jakieś geny oprócz UBE3A są zmienione (ang. affected). Musimy wiedzieć, jak długo trwa aktywacja po leczeniu. I oczywiście musimy wiedzieć, jaki wpływ ma to leczenie na zachowania myszy Angelmana. Wszystkie te badania są również teraz w toku. Jedną z rzeczy, jaką my i inni nauczyliśmy się, jest to, że objawy na naszym modelu myszy Zespołu Angelmana są dużo łagodniejsze niż te, które co zazwyczaj obserwujemy u ludzi. Mamy kilka pomysłów, dlaczego tak może być i przy pomocy „Foundation for Angelman Syndrome Therapeutics (FAST)”, budujemy lepsze modele gryzoni tej choroby. Jeśli uda się to zrobić, to nowe modele pomogą nam i reszcie społeczności naukowej w testowaniu leków i rozwijaniu nowych celowych terapii.

Myślę, że postęp, który został osiągnięty w ciągu zaledwie kilku ostatnich lat:

1. odkrycie przez doktora Bena Philpota leku aktywującego gen UBE3A,
2. eksperymenty terapii genowej doktora Edwarda Weebera przywracające wyrażanie genu UBE3A u myszy,
3. eksperymenty terminacji antysensowej doktora Art Beaudeta,
4. terapia oligonuclotidowa

są bardzo ekscytujące i na pewno dają nadzieję na lepsze leczenie. Ja zostałem z pewnością zainspirowany ich pracą oraz wsparciem szerszej społeczności Zespołu Angelmana i cieszę się, że mogę w tym uczestniczyć.

* Bailus i Segal: Perspektywa terapii molekularnej dla zespołu Angelmana i innych jedno-genowych zaburzeń neurologicznych. BMC Neuroscience +2014 15:76.

Źródło:
http://cureangelman.net/
https://blog.cureangelman.org/molecular-therapies-professor-david-segal/